还在做划痕实验？——来看看3D培养水平的wound healing实验吧！

今天我们要来谈一谈划痕实验（scratch assays），确切的说，是伤口愈合实验（Wound healing）。提到这一类的实验，想必很多实验室的同胞们会对其设计、操作和结果分析感到十分困惑：如何保证划痕的均匀一致？结果如何分析？为什么每次实验的重复性很差？其实，当大家沉浸在划痕实验的爱与痛中的时候，结合纳米材料与微孔板全自动成像技术已经占领3D世界的Wound healing assay了！

对于如何实现3D培养水平的损伤修复实验，先不谈实验技术本身，我们来确认一下这种模型的意义，大家都知道，Scratch assays本身是为了评估细胞的损伤修复和迁移的能力，而生物体内真实的损伤修复都是在极为复杂的细胞微环境调控网络下进行的，可以理解为，真实的细胞生长的环境是一个多民族聚集的三次元大家庭，而不是现在我们大多数实验条件限制下构建的二次元模型。因此，如果采用3D培养细胞模型来进行损伤修复实验，才能够获得更加贴近体内的研究的实验结果，避免许多弯路。

那么各位一定和我一样有这样几个问题：3D培养模型应该很难构建吧？如何方便的检测3D细胞培养模型？能快速实现结果定量分析吗？对于这些技术层面的问题，BioTek都有轻松的解决方案。

Q1：如何实现3D细胞woundhealing模型的构建？听起来不简单啊！

       伴随着材料学的进步，通过n3D公司的基于纳米材料的“磁力悬浮”系统构建体外3D wound healing模型，这种模型构建方式最大的优势是3D成球速度非常快，原本需要数天甚至数周以上的模型构建周期，如果采用磁力悬浮系统，仅需15分钟至数小时即可构建。操作方法的示意图见下图所示：

图1：”磁力悬浮系统”构建3Dwound healing模型示意图。A，加入生物亲和性的纳米材料磁化细胞。B，将磁化后的细胞转移至顶部带有磁子的6孔板中使其悬浮自然形成胞外基质（ECM）。C，形成胞外基质的细胞体系转移至底部具有环形磁子的384/96孔Woundhealing 模型培养板中培养数小时。

由此可见，采用这种磁力悬浮系统，能够快速有效的构建形成胞外基质的3D损伤愈合模型。生命科学的研究往往是从量变到质变的积累突破，只有样本量达到一定的数量，我们才能获得有效的实验结果，之前我们可能认为培养数个3D细胞球已经很难了，更何况是要进行多个样品重复，评估多种药物/化合物或刺激因素呢？而我们这里介绍的这个模型，恰好非常有效地解决了样本通量的问题。

Q2，3D模型虽然很好，但是不好检测啊，有人用Confocal拍一个3D细胞球都要好几个小时，这几十上百个的，如何获得结果？

    这个问题，就要轮到大名鼎鼎的Cytation^TM系列多功能细胞成像检测仪登场（详细介绍请回顾公众号历史消息）。Cytation^TM成像模块最大的特点就是，“想怎么拍，就怎么拍”，无论我们是想拍小视频、多视野拼图、多色荧光叠、Z-轴层切、无固定视野多孔拍摄等等，Cytation^TM都只需要一个简单的程序就能一次搞定，还能让你实现任意时间的活细胞自动监测，是不是很方便？像今天介绍的这种3D wound healing模型，我们需要对每个细胞团清晰成像，最好还能在不同时间点成像，这样能够更全面的评估损伤愈合的过程（图2，3）。

图2：Cytaiton对不同时间点3D培养的未给药组模型损伤愈合情况自动拍摄的图像。4X物镜，相差成像。

图3：Cytaiton对不同时间点3D培养的给药组（cytochalasin D）模型损伤愈合情况自动拍摄的图像。

以上两张图清晰地展示了无药物处理的3D细胞模型，每隔一定时间成像检测结果显示所有细胞逐渐向中心区域迁移，使这个环形“伤口”逐渐向中心愈；而使用了细胞松弛素D的模型组，环状的3D 细胞团不再向中间生长，提示损伤修复功能受到抑制。

除了相差或明场的观测，如果我们想要评估多种细胞混合培养以后，每种细胞的迁移或增殖速度，就需要用到荧光标记或荧光蛋白转染的方法了，由于Cytation可以自动对多通道荧光叠加成像，我们也可以在此模型基础上进行更多的研究。

图4：Cytation^TM荧光成像通道展示表达RFP的成纤维细胞在共培养3D wound healing模型中的分布。

Q3，光有图片怎么行？我们需要用数据来说话，这个模型如何进行图像定量分析？

从前面可以看出，基于磁力悬浮系统构建的3D woundhealing模型，是通过评估环形3D细胞球的细胞向中心迁移的程度来反应损伤愈合的过程，随着细胞迁移，环形3D细胞球的总面积减少。因此，我们需要从图片上获得环形3D细胞球总面积的实时变化。Cytation^TM检测平台系统的控制及分析软件Gen5，带有多种灵活的图像分析功能，包括细胞计数、细胞面积、细胞周长、细胞亚群分析、多Mask圈选、多种曲线拟合等功能。在进行图像分析时，同样只需要编辑数个分析步骤，即可对整个实验中每个时间点的图像进行分析。因此，即使是384孔板的N个时间点的图像，Gen5软件也能快速自动化帮大家得到分析结果。

图5，Gen5软件展示对3Dwound healing模型的分析结果。AB，给药组及对照组样品细胞金色轮廓Mask圈选，统计总面积。右上，每隔30mins，连续监测16h的不同给药浓度条件下，对HT1080细胞3D模型的损伤修复曲线。右下，16h后，Cytochalasin D的损伤修复抑制作用的Dose-Response曲线及IC50值（可点击放大图片查看）。

图5非常棒的展示了Gen5强大的图像分析运算能力，右上角的动力学损伤愈合曲线，每个点代表一个时间点的一张图像的分析结果，而评估一个化合物一般需要8个浓度梯度，一共32个时间点，因此这一个实验需要分析256张以上的图像，如果再做重复样品，则需要更大的样品分析量。如果没有Cytation^TM和Gen5软件的强强联合，恐怕这样的实验设计，我们早已望而却步啦。而现在，我们不但有基础的动力学曲线，还能轻松获得每个药物的EC/IC50，提供严谨的药学研究实验数据，无需将大量的数据样本在不同的分析软件中来回转移。

对于整个实验，大家关心的三个问题，在Cytation&Gen5的联合出击下，都应迎刃而解，而需要你做的，就是动用聪明的大脑，去设计更多有趣、严谨的实验项目，而不用担心耗费大量的时间和精力，去做重复性的劳动来进行图像捕获及数据分析。